Allereerst laten zowel EcoR1 als Xba1 5' overhangen achter wanneer ze DNA verteren (net als Nde1). In beide gevallen is het 3'-uiteinde verzonken, daarom kan polyermase basen toevoegen. Ten tweede kunnen alle polymerasen alleen basen toevoegen aan een 3'-uiteinde, dus de Klenow zal 4 basen toevoegen aan het teruggetrokken 3'-uiteinde van beide plaatsen om stompe uiteinden te genereren.
Laat restrictie-enzymen een 5 fosfaat achter?
Vectors en inserts die zijn verteerd door restrictie-enzymen bevatten de noodzakelijke terminale modificaties (5'-fosfaat en 3'-hydroxyl), terwijl fragmenten gecreëerd door de Polymerase Chain Reaction (PCR) dat niet kunnen.
Kunnen stompe uiteinden worden afgebonden?
Blunt-end ligatie
Blunt-end ligatie omvat geen basenparing van de uitstekende uiteinden, dus elk stomp uiteinde kan worden geligeerd aan een ander stomp uiteinde. Stompe uiteinden kunnen worden gegenereerd door restrictie-enzymen zoals SmaI en EcoRV.
Maakt Taq-polymerase stompe uiteinden?
Yes… Taq Polymerase voegt A-Overhangs toe als u de laatste verlengingsstap op 72 dC houdt op PCR. Meestal gebruikt voor TA Cloning.
Waarom het Klenow-fragment gebruiken bij DNA-sequencing?
Het Klenow-fragment is uitermate nuttig voor op onderzoek gebaseerde taken zoals: Synthese van dubbelstrengs DNA uit enkelstrengs sjablonen . Vullen teruggetrokken 3'-uiteinden van DNA-fragmenten om de 5'-overhang stomp te maken . Uitstekende overhangen van 3' verteren.
